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Oncology lettere clorochina ha tumorinhibitory e gli effetti tumorpromoting in triplenegative cancro al seno Autori: Johanna Tuomela Jouko Sandholm Joonas Kauppila H. Petri Lehenkari Kevin W. Harris Katri S. Selander Affiliazioni: Dipartimento di Medicina, Università di Alabama a Birmingham, Birmingham, AL 35294, Stati Uniti d'America , Dipartimento di Anatomia e Biologia cellulare, Università di Oulu, Oulu 90014, Finlandia Pubblicato on line: il Venerdì, 4 ottobre 2013 Pagine: 1665-1672 doi: 10,3892 / ol.2013.1602 Questo articolo è menzionato in: astratta Tolllike receptor9 (TLR9) è un recettore intracellulare DNA che è ampiamente espresso in seno e altri tumori. Abbiamo precedentemente dimostrato che un basso livello tumore TLR9 espressione al momento della diagnosi è associata con tempi di sopravvivenza diseasespecific significativamente accorciati in pazienti con cancro al seno triplenegative (TNBC). Non ci sono terapie mirate per questo sottogruppo di pazienti la cui prognosi è tra i peggiori in cancro al seno. A causa delle in vitro antiinvasive effetti precedentemente rilevate di clorochina in queste linee cellulari, il presente studio ha lo scopo di indagare gli effetti in vivo della clorochina contro due sottotipi clinici di TNBC che differiscono nell'espressione TLR9. La clorochina soppresso metalloproteinasi della matrice (MMP) 2 e MMP9 mRNA espressione e di proteine di attività, mentre l'espressione MMP13 mRNA e l'attività proteolitica sono stati aumentati. Nonostante migliorando espressione TLR9 mRNA, clorochina soppressa l'espressione della proteina TLR9 in vitro. Trattamento quotidiano di topi con intraperitoneale (i. p.) clorochina (80 mg / kg / die) per 22 giorni, non ha inibito la crescita delle cellule del cancro al seno controllo siRNA o TLR9 siRNA MDAMB231. In conclusione, nonostante il favorevole vitro sulla TNBC invasione e la vitalità, in particolare in condizioni di ipossia, clorochina non impedisce la crescita delle cellule triplenegative MDAMB231 con alti o bassi livelli di espressione TLR9 in vivo. Ciò può essere spiegato dagli effetti attivanti di clorochina sull'espressione MMP13 o per il fatto che la clorochina, sopprimendo l'espressione TLR9, permette l'attivazione di percorsi molecolari attualmente sconosciuti, che permettono il comportamento aggressivo delle cellule TNBC con espressione basso TLR9 in ipossia. Introduzione di tutti i pazienti con cancro mammario, quelli con tumori triplo-negativi che mancano l'espressione del recettore per gli estrogeni (ER), recettore del progesterone e recettore HER2, sopportare le prognosi più poveri (1). Ciò è dovuto al comportamento aggressivo delle cellule di carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) e la mancanza di terapie mirate per questo particolare sottogruppo. TNBC è, tuttavia, una malattia altamente eterogeneo e informazioni più specifiche relative alla biologia dei vari sottotipi è richiesto per future terapie mirate (1, 2). Toll-like receptor-9 (TLR9) è un recettore immunità innata DNA che è stato identificato in cellule del sistema immunitario (3). ligandi agonistica TLR9, come microbica e vertebrati DNA o sintetici CpG-sequenza contenenti oligonucleotidi, inducono una reazione infiammatoria nelle cellule che esprimono TLR9. Oltre a indurre il rilascio di citochine (4, 5) in cellule tumorali, agonisti TLR9 inducono anche l'invasione in vitro. che è mediata attraverso l'attivazione delle metalloproteinasi di matrice (MMP), come MMP-13 (6 8). Abbiamo precedentemente dimostrato che TLR9 ha un ruolo importante nella TNBC (9) e ha dimostrato che, mentre la bassa tumore espressione TLR9 è stato associato con petto di sopravvivenza cancro-specifica significativamente ridotta nei pazienti con TNBC, TLR9 non aveva alcun valore prognostico nei pazienti con cancro mammario con tumori ER (9). Questo è probabilmente, almeno in parte, spiegato dal comportamento ipossia-associata di cellule TNBC che esprimono livelli bassi TLR9. Abbiamo rivelato che, sebbene diminuita espressione TLR9 in TNBC cellule, diminuendo l'invasione quando le cellule tumorali sono in normossia, le cellule diventano altamente invasiva in ipossia (9). Questi risultati suggeriscono che TLR9 ha anche effetti ligando-indipendente su invasione e che, in assenza di espressione TLR9 in ipossia, un altro percorso è il mediatore effettivo di invasione. Il percorso che media invasione ipossia in assenza di TLR9 non è attualmente noto. Inoltre non è noto se possibile ridotta infiammazione TLR9-mediata al sito del tumore contribuisce alla prognosi sfavorevole in questo sottogruppo di TNBC. Dal momento che le cellule TNBC indotta da ipossia nell'invasione vitro e la vitalità di esprimere bassi livelli di TLR9 è stato inibito in vitro da clorochina (9), una malaria consolidata e reumatoide farmaco contro l'artrite che è noto per interferire con la segnalazione endosomal, il presente studio ha lo scopo per caratterizzare ulteriormente l'efficacia anti-tumorale di clorochina contro le cellule TNBC con differenze di espressione TLR9. Materiali e metodi di coltura cellulare genitori-231 MDA-MB cellule del cancro al seno e D54MG, U373MG, le cellule Caco-2 e AGS sono state coltivate in Dulbeccos modificato Eagles medio (Gibco BRL, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) supplementato con 10 calore inattivato siero fetale bovino, L-glutammina, penicillina / streptomicina e aminoacidi non essenziali (tutti da Gibco BRL, Life Technologies) (10). Le cellule sono state coltivate in incubatori a 37 ° C, con un clima di 5 CO 2/95 aria con 21 pO 2 o in un incubatore ipossia con 5 PO 2 (I-Guanto BioSpherix, Ltd. Lacona, NY, USA). Il siRNA di controllo stabile e TLR9 siRNA MDA-MB-231 cellule sono state descritte in precedenza e sono state coltivate in presenza di G418 (800 g / ml) (9). La clorochina è stato acquistato da Sigma (St. Louis, MO, USA). isolamento RNA e quantitativa (q) PCR L'RNA totale è stato isolato dalle cellule utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) e purificato con kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Germania). Tutti i reagenti per gli esperimenti qPCR sono stati acquistati da Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). cDNA è stato sintetizzato da 0,2 g RNA totale, utilizzando MultiScribe trascrittasi inversa e esameri casuali. Quantificazione dell'espressione TLR9 mRNA è stata eseguita come descritto in precedenza (11). Gli altri set di primer e sonde che sono stati utilizzati (MMP-2, MMP-9, MMP-13 e TIMP-3) sono stati acquistati da Applied Biosystems set di primer / sonda come ready-made. Un programma di amplificazione standard è stato utilizzato per tutte le amplificazioni (1 ciclo di 50C per 2 min, 1 ciclo di 95C per 10 minuti, 40 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min). Successivamente alla normalizzazione con proteina ribosomiale livelli L15 (RPLO) espressione per ogni cDNA, la quantificazione relativa del cDNA bersaglio è stata effettuata utilizzando 2 valori ct. Analisi Western Blot Le cellule sono state coltivate in piastre da 6 pozzetti con normale mezzo di coltura fino nei pressi di confluenza, dopo di che sono stati risciacquati con sterile PBS (PBS) e coltivate ulteriormente per i tempi indicati nel terreno di coltura privo di siero. Al tempo-punti desiderati, il terreno di coltura è stata scartata e le cellule sono state rapidamente raccolto in tampone di lisi (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, USA) e chiarito per centrifugazione, come (8) descritto in precedenza. Successivamente all'ebollizione sovranatanti nel ridurre sodio dodecil solfato (SDS) tampone, uguali quantità di proteine (100 g) sono stati caricati per corsia ed i campioni sono stati sottoposti ad elettroforesi in 10 o 420 gel SDS poliacrilammide gradiente (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules , CA, USA), poi trasferito in una membrana di nitrocellulosa. Per rilevare TLR9, le macchie sono state incubate per una notte a 4 ° C con anticorpi anti-TLR9 (IMG-431 Imgenex, San Diego, CA, USA), diluito 1: 500 in soluzione salina Tris tamponata con 0,1 (v / v) Tween-20 ( TBST). Pari di carico è stata confermata con policlonale di coniglio anti-actina (Sigma A-2066, utilizzato a 1: 1000 diluizione). rilevazione secondaria è stata eseguita con anticorpi secondari perossidasi di rafano-linked (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Le bande proteiche sono state visualizzate mediante chemiluminescenza utilizzando un kit ECL (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL, USA). La vitalità cellulare Saggi Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti (20.000 cellule per 100 l per pozzetto) nel normale terreno di crescita. La vitalità delle cellule è stata misurata con il One Solution saggio Cell Proliferation CellTiter 96 acquosa (Promega Corporation, Madison, WI, USA), secondo le raccomandazioni del produttore. In un'altra serie di esperimenti, le cellule sono state piastrate in piastre da 24 pozzetti e dopo il tempo indicato, le cellule sono state tripsinizzate e le cellule vitali sono state contate dopo colorazione blu trypan usando un contatore automatico di cellule TC10 (Bio-Rad Laboratories). Zimografia Le cellule sono state incubate per 2448 h in mezzi senza siero. I surnatanti sono stati raccolti e concentrati usando un dispositivo di filtro centrifugo (Millipore, Billerica, MA, USA dimensione cut-off 3 kDa, cat n. UFC5-003-24). Uguali quantità di proteine (20 g) sono stati caricati per corsia di gel zimogramma (10 gelatina, Bio-Rad Laboratories). I gel sono stati poi Esegui, renaturated, sviluppate e testate in base Bio-Rad buffer zimogramma, secondo le raccomandazioni del produttore. Animal studi di controllo e TLR9 siRNA MDA-MB-231 cellule (510 5 cellule in 100 l) sono state inoculate nei cuscinetti adiposi mammarie di quattro settimane di età, i topi immuno-deficienti (atimici nudi / nu Foxn1 Harlan Sprague Dawley, Inc. Indianapolis, IN, USA). I trattamenti sono stati avviati sette giorni dopo l'inoculazione delle cellule tumorali. I topi sono stati trattati giornalmente sia con intraperitoneale (i. p.) clorochina (80 mg / kg) o veicolo (PBS). Gli animali sono stati monitorati giornalmente per i segni clinici. misurazioni tumorali sono state eseguite due volte la settimana e il volume del tumore è stato calcolato secondo la formula V (/ 6) (d 1 d 2) 3/2. dove d 1 ed 2 sono diametri perpendicolari tumorali (9). I tumori sono stati autorizzati a crescere per 22 giorni, a quel punto i topi sono stati sacrificati ed i tumori sono stati sezionati per una misura definitiva. Nel corso degli esperimenti, gli animali sono stati mantenuti in condizioni esenti da organismi patogeni controllati ambientali (2021C, 3060 umidità relativa e un ciclo di illuminazione di 12 ore). I topi sono stati alimentati con pellet cibo piccole-animale (Harlan Sprague Dawley) e forniti con sterili acqua ad libitum. Le procedure sperimentali sono stati esaminati e approvati dalla University of Alabama a Birmingham Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso. Analisi statistica I risultati sono presentati come l'SD media o media SEM, come dichiarato. Studenti spaiati t-test sono stati utilizzati per calcolare differenze statisticamente significative tra i vari gruppi di studio in in vitro e in vivo esperimenti pre-clinici. Risultati Effetti della clorochina sulla vitalità cellulare dei genitori MDA-MB-231 cellule Poiché il comportamento delle cellule TNBC sono sensibilmente influenzati da ipossia (9, 12), tutti gli esperimenti sono stati condotti in normossia (pO 2 21) e ipossia (pO 2 5) condizioni di coltura. In primo luogo, gli effetti della clorochina sulla vitalità cellulare dei genitori MDA-MB-231 cellule sono state indagate. In accordo con le nostre osservazioni precedenti (9), condizioni di coltura ipossiche indotto un significativo aumento della vitalità cellulare dei genitori MDA-MB-231 rispetto a culture che sono stati tenuti in normossia (9). L'aggiunta di 25 M clorochina non pregiudica MDA-MB-231 vitalità in normossia, mentre il 50 M clorochina aveva un leggero ma significativo effetto inibitorio. Né dose di clorochina, tuttavia, completamente bloccato l'aumento indotto dall'ipossia della redditività (Fig. 1A). Studi simili sono stati condotti anche con MDA-MB-231 cellule che sono state trasfettate stabilmente con il controllo siRNA - o TLR9 plasmidi siRNA-encoding. Clorochina anche inibito l'aumento indotto dall'ipossia in redditività in queste due linee cellulari (Fig. 1B e C). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che dose-dipendente clorochina inibisce la vitalità ipossia indotta di MDA-MB-231 cellule e che questi effetti sono indipendenti dallo stato dell'espressione TLR9 delle cellule. Figura 1 (A) parentale MDA-MB-231, (B) MDA-MB-231 di controllo siRNA e (C) MDA-MB-231 cellule TLR9 siRNA sono state coltivate in normossia (pO2 21) e ipossia (pO2 5) condizioni di coltura per 24 ore, dopo di che la vitalità cellulare è stata misurata con MTS-test. I dati sono espressi come media SEM, n6. P MTS, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-il) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4sulfophenyl) -2H-tetrazolio, Effetti sale interne della clorochina sull'espressione TLR9 ipossia indotta successivo, gli effetti di clorochina sull'espressione TLR9 indotta da ipossia sono stati studiati. Come anche precedentemente rilevato, ipossia induce un significativo aumento dell'espressione TLR9 mRNA nei parentali MDA-MB-231 cellule (Fig. 2A). Questo effetto è stato notevolmente arricchito da clorochina nelle condizioni di coltura normossiche e ipossia. In ipossia, l'effetto di clorochina è, tuttavia, significativamente ridotto (Fig. 2B). Effetti simili su TLR9 mRNA espressione da clorochina sono state rilevate anche nelle D54MG e U373MG cervello linee di cellule tumorali (Fig. 2C e D). Inoltre, una tendenza simile nell'espressione TLR9 mRNA è stata anche rilevata nel colon-retto Caco-2 e AGS umano e linee cellulari di adenocarcinoma gastrico, rispettivamente (Fig. 2E). A livello di proteine, tuttavia, clorochina diminuita MDA-MB-231 espressione proteica TLR9, in normossia e ipossia (Fig. 2F). Effetti simili sulle proteine TLR9 sono state rilevate anche nel controllo delle cellule siRNA e TLR9 siRNA (Fig. 3). Presi insieme, questi studi suggeriscono che la clorochina ha effetti opposti su TLR9 mRNA e l'espressione della proteina. Figura 2 (a) Parental MDA-MB-231 cellule sono state coltivate per 24 ore sotto ipossia e normossia. L'espressione di TLR9 mRNA è stata misurata con qPCR media SEM, n6. P TLR9, toll-like receptor-9. Figura 3 Occidentale blot di proteine TLR9 in siRNA controllo o TLR9 siRNA MDA-MB-231 cellule dopo coltura per 24 h sotto normossia (N) o ipossia (H), in presenza di veicolo o 25 o 50 M clorochina. banda actina dello stesso macchia spogliato è mostrato per indicare la parità di carico. TLR9, toll-like receptor-9. Effetti di clorochina su MMP-2, MMP-9 e MMP-13 mRNA espressione e l'attività proteolitica di cellule TNBC ad alta e bassa espressione TLR9 TLR9 invasione ligando-indotta ha dimostrato di essere associata con l'attivazione di MMP-13 (6 8 ). Dal momento che la clorochina inibisce l'invasione TLR9-ligando-indotta in normossia in vitro. gli effetti della clorochina su MMP-2, MMP-9 e MMP-13 mRNA, come pure l'attività proteolitica di cellule TNBC con espressione alta e bassa TLR9 sono stati studiati. La clorochina ha avuto, effetti simili soppressivi su MMP-2 espressione di mRNA in normossia e ipossia in tutte le cellule studiate (Fig. 4A). Gli effetti sul MMP-9 espressione di mRNA erano più dose e l'ossigeno-status dipendente. Mentre 25 M clorochina soppresso MMP-9 espressione di mRNA in normossia e ipossia, la dose da 50-M è stato meno soppressiva in normossia e non sopprimere MMP-9 espressione di mRNA in parentali MDA-MB-231 cellule in ipossia. Effetti simili sono stati osservati nel controllo e TLR9 siRNA MDA-MB-231 cellule, con l'eccezione che, nelle cellule TLR9 siRNA rispetto al veicolo-trattamento, 50 M clorochina indotto significativa soppressione di MMP-9 espressione di mRNA in normossia e ipossia ( Fig. 4B). La clorochina aveva anche un duplice effetto, al dosaggio di MMP-13 mRNA. In normossia e ipossia, la dose 25-M indotto alcun cambiamento o leggermente soppresso MMP-13 espressione di mRNA in tutte le cellule studiate. La concentrazione più elevata clorochina (50 M), tuttavia, induce un aumento significativo di MMP-13 mRNA in normossia in tutte le cellule. Questa induzione di MMP-13 mRNA è stata ulteriormente migliorata significativamente dall'ipossia nelle cellule siRNA controllo, ma è diminuito nelle cellule TLR9 siRNA (Fig. 4C). dose e ossigeno effetti di stato-dipendenti simili su MMP-13 espressione di mRNA sono state rilevate anche nelle linee di cellule di glioblastoma D54MG e U373MG umani. La dose più piccola non ha avuto o solo un effetto leggermente soppressivo sul MMP-13 mRNA, mentre la dose più elevata indotto MMP-13 mRNA in un livello-dipendente della moda di ossigeno (Fig. 4D). Il Caco-2 e cellule AGS sono stati studiati solo in normossia. Nelle cellule Caco-2, 50 M clorochina ha avuto alcun effetto sul MMP-9 mRNA, ma soppresso MMP-2 mRNA e in modo significativo indotto MMP-13 espressione di mRNA. Allo stesso modo, 50 M clorochina anche indotto MMP-13 espressione di mRNA nelle cellule AGS (Fig. 4E). Presi insieme, questi studi suggeriscono che la clorochina ha effetti dose-dipendente e ipossia-cellulo su MMP-2, MMP-9 e MMP-13 espressione di mRNA. Più in particolare, alte dosi di clorochina sembrano indurre più MMP-13 mRNA espressione, sopprimere meno MMP-9 espressione di mRNA e, in ipossia, questi effetti sembrano essere TLR9-dipendente. Figura 4 Espressione di (A) MMP-2, (B) MMP-9 e (C) MMP-13 mRNA in parentali MDA-MB-231 cellule, controllare cellule siRNA o TLR9 siRNA in normossia e ipossia, misurata con qPCR. Le barre rappresentano cambiamenti clorochina indotte espressione di mRNA, rispetto al veicolo-trattamento (linea tratteggiata) in normossia e ipossia significare SEM, n36. P TLR9, toll-like receptor-9. Effetti della clorochina sul MMP a livello proteina funzionale per indagare se gli effetti chloroquines su MMP mRNA sono tradotti al livello di proteina funzionale, zimogrammi sono stati eseguiti utilizzando il surnatante cellulari seguenti i vari trattamenti. Successivamente 24 ore di trattamento, la MMP 2 pro-bande proteolitici pro-MMP-9 e erano chiaramente visibili (13), ma non chiare differenze sono state rilevate in attività proteolitica tra i vari trattamenti delle cellule studiate (Fig. 5A) . Tuttavia, dopo 48 ore, mentre la MMP-2 e MMP-9 attività sono state soppresse dalla clorochina, MMP-13 attività proteolitica ha cominciato ad emergere negli stessi campioni (Fig. 5B). I dati viene visualizzata solo per le cellule TLR9 siRNA in normossia, anche se sono stati rilevati risultati simili per tutte le celle studiate in normossia e ipossia. Figura 5 (A) analisi degli zimogrammi rileva dei supernatanti da veicolo, 25 o 50 M parentali MDA-MB-231 cellule clorochina-trattati o controllare le cellule siRNA o TLR9 siRNA dopo 24 ore di trattamento in normossia (N) o ipossia (H). (B) zimogramma di supernatanti da veicolo, 25 o 50 M clorochina trattati con siRNA TLR9 MDA-MB-231 cellule in normossia. Le frecce indicano il 92 kDa pro-MMP-9 (freccia tratteggiata) e il 72 kDa pro-MMP-2 (freccia nera). Il 40 kDa banda rappresenta MMP-13 (freccia rossa). MMP, metalloproteinasi della matrice TLR9, toll-like receptor-9 CQ, clorochina. l'efficacia anti-tumorale di clorochina in un modello di mouse ortotopico L'efficacia anti-tumorale di clorochina è stata studiata in un modello di mouse ortotopico, utilizzando il controllo siRNA e TLR9 siRNA MDA-MB-231 cellule. A seguito di inoculazione delle cellule tumorali e la creazione di tumori sette giorni dopo, i topi sono stati trattati giornalmente con via intraperitoneale clorochina (80 mg / kg). Come previsto, le cellule TLR9 siRNA formano i tumori significativamente più grande rispetto alle cellule di controllo siRNA durante l'esperimento. trattamento Clorochina non ha inibito la crescita tumorale sia nel siRNA controllo o gruppi TLR9 siRNA (Fig. 6A e B). Nel loro insieme, nonostante le antitumorali e anti-invasive effetti favorevoli che presenta clorochina contro le cellule del cancro al seno testati in vitro. i risultati suggeriscono che la clorochina non impedisce la crescita di queste cellule nel sito ortotopico in vivo. Figura 6 (A) Crescita dei tumori ortotopico formate da controllo siRNA o TLR9 siRNA MDA-MB-231 cellule. Media SEM, N20. P0.05, veicoli trattati tumori TLR9 siRNA contro i tumori di controllo siRNA veicoli trattati, e clorochina trattati tumori TLR9 siRNA contro i tumori siRNA controllo clorochina-trattati. TLR9, toll-like receptor-9. Discussione Nell'era attuale delle crescenti costi di cura del cancro, ci sta emergendo interesse per l'individuazione di nuovi impieghi per i vecchi farmaci (14, 15). Ad esempio, la clorochina ha dimostrato effetti promettenti come un agente anti-cancro, in particolare nei tumori al seno (16 19). La clorochina ha dimostrato di inibire la crescita del cancro al seno in vitro, e basse dosi di clorochina hanno indotto la resistenza alla carcinogenesi mammaria in un modello murino di tumori al seno chimicamente indotti (20, 21). Dato che il nostro precedente i dati in vitro ha suggerito che la clorochina inibisce la capacità invasiva delle cellule TNBC con il molto aggressivo basso TLR9 espressione fenotipo (7, 8), il presente studio ha lo scopo di studiare gli effetti antitumorali di questo ampiamente utilizzato, anti-malarica e reumatologia droga in un modello di topo che imita la malattia umana aggressiva in vivo. Secondo i nostri dati preliminari, questi pazienti con bassi TLR9-TNBC e poveri prognosi possono rappresentare fino al 10 di tutti i pazienti affetti da cancro al seno (9). Gli attuali risultati hanno dimostrato che, nonostante la crescita ipossia-associati effetti inibitori promettenti in vitro. clorochina non inibisce la crescita locale di tumori formati dalle stesse cellule in vivo. La ragione per la discrepanza tra in vitro ed in vivo risultati è attualmente poco chiaro e richiede ulteriore caratterizzazione. crescita tumorale locale è la somma della proliferazione cellulare e invasione locale. Così la mancanza di inibizione della crescita tumorale può, almeno in parte, essere spiegata dagli effetti pro-invasivi di clorochina, come aumento MMP-13 attività, che a livello proteico manifesta entro gli effetti anti-invasivi e inibitori della crescita e che può essere più pronunciato in condizioni di ipossia. I risultati attuali sono l'opposto di quelli pubblicati da Jiang et al (22), il quale ha osservato che la clorochina inibisce la crescita di sottocutanea (s. c.) 4T1 tumori della mammella e metastasi polmonari in vivo. Clorochina, da solo o in combinazione con il RAD001 inibitore mTOR, ha dimostrato di inibire la crescita in vivo di ortotopico MCF-7 tumori (21). Le differenze nei risultati possono essere spiegati con le diverse linee cellulari e il dosaggio del farmaco è possibile che, per esempio, gli effetti MMP-13-attivazione di clorochina manifestano solo con le dosi clorochina elevate, simili a quelli utilizzati nei nostri studi . Una parte delle differenze nelle risposte clorochina può essere spiegato con lo stato p53 delle linee cellulari. La clorochina è nota per indurre arresto del ciclo cellulare attraverso l'attivazione del soppressore del tumore p53, che è mutato in MDA-MB-231 cellule (20). I risultati attuali, che ha dimostrato che la clorochina inibisce l'aumento della redditività ipossia indotta di queste cellule, suggeriscono che in ipossia, la clorochina potrebbe indurre altre vie di morte cellulare o l'arresto della crescita, indipendentemente p53. Questo è confermato dal fatto che le cellule 4T1 hanno dimostrato di essere p53 null (23). TLR9 è un recettore DNA cellulare che, in base alle nostre osservazioni, sembra regolare l'invasione delle cellule di cancro in assenza di ligandi DNA esogeno aggiunti. Clorochina ha dimostrato di inibire TLR9 ligando indotta reazioni infiammatorie nelle cellule e questo effetto è stato attribuito alla inibizione di endosomi acidificazione e, più recentemente, per dirigere vincolante della clorochina agli acidi nucleici, mascherando così loro epitopi TLR9 vincolante (24). In particolare, il presente studio ha rivelato che il trattamento con clorochina upregulates espressione TLR9 mRNA nelle cellule tumorali. Questo effetto sul mRNA è stato leggermente ridotto in ipossia, ma non si è tradotto in un aumento dei livelli di proteine TLR9, anche in condizioni di ossigeno piene. Al contrario, il trattamento clorochina in realtà ha provocato l'espressione della proteina TLR9 diminuito. I presenti risultati concordano con quelli di Zhu et al (25), che ha dimostrato che la clorochina inibisce l'espressione TLR9 in cellule dendritiche. La ragione di questi risultati non è chiara, ma può essere che un pH basso è necessario per il corretto ripiegamento delle proteine TLR9 o il coinvolgimento di microRNA specifici che inibire l'espressione TLR9. Bloccando l'acidificazione degli organelli endosomiali dove risiede TLR9, clorochina può realmente accelerare la degradazione della proteina TLR9. Sebbene Kuznik et al (24) hanno dimostrato che la clorochina non aumenta il pH endosomi, la concentrazione di clorochina questi autori utilizzato era significativamente più piccola rispetto alle attuali esperimenti (4 vs 2550 M). Questi problemi richiedono un ulteriore caratterizzazione biochimica a livello cellulare. Un'altra possibile spiegazione perché clorochina non impedisce la crescita tumorale in questo modello è che riducendo espressione TLR9 può promuovere altamente aggressiva bassa espressione TLR9 fenotipo delle cellule TNBC (9), permettendo così l'attivazione della via attualmente sconosciuto di crescita aggressiva e l'invasione . In conclusione, nonostante il promettente TLR9 di stato indipendente di inibizione della crescita e anti-invasiva in effetti in vitro contro le cellule TNBC in normossia e ipossia, la clorochina non inibisce la crescita di tumori ortotopico TNBC in vivo. Inoltre, promuovendo MMP-13 attivazione e sopprimendo l'espressione TLR9 in tali condizioni, clorochina può essere una scelta particolarmente scarsa per i tumori che sono ipossica. Clorochina può, tuttavia, avere inibitori della crescita e anti-metastatiche contro altri tipi di seno o altri tumori. Ringraziamenti Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni da parte del Dipartimento della Difesa (W81XWH-10-1-0308, KSS), Lapponia Fondazione Culturale (KSS), Elsa U. Pardee Foundation (KSS), Maud Kuistila Memorial Foundation (JT), Finlandese culturale Fondazione (JS), Emil Aaltonen Foundation (JHK), Cancer Foundation del Nord Ostrobotnia (JHK), Oulu University Research Foundation (JHK), Georg C. e Maria Ehrnroot Foundation (JHK), Orion-Farmos Research Foundation (JHK) e il Finnish Medical Foundation (JHK). Christine Pressey è riconosciuto per fornire assistenza con i saggi qPCR. Riferimenti Tuomela, J. Sandholm, J. Kauppila, J. H. Lehenkari, P. Harris, K. W. Selander, K. S. (2013). La clorochina ha effetti tumorinhibitory e tumorpromoting nel cancro della mammella triplenegative. Oncologia lettere, 6, 1665-1672. http://dx. doi. org/10.3892/ol.2013.1602 Tuomela, J. Sandholm, J. Kauppila, J. H. Lehenkari, P. Harris, K. W. Selander, K. S .. Oncologia lettere 6.6 (2013): 1665-1672. Tuomela, J. Sandholm, J. Kauppila, J. H. Lehenkari, P. Harris, K. W. Selander, K. S .. Oncologia lettere 6, no. 6 (2013): 1665-1672. http://dx. doi. org/10.3892/ol.2013.1602
