Clorochina 96

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Affiliazione: Dipartimento di Patologia, Università di Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, Oklahoma, Stati Uniti d'America Astratto Clorochina è un agente antimalarico stabilito che è stato recentemente testato in studi clinici per la sua attività antitumorale. L'effetto favorevole della clorochina sembra essere dovuto alla sua capacità di sensibilizzare le cellule tumorali alla chemioterapia, radioterapia, e indurre l'apoptosi. Il presente studio ha esaminato l'interazione di ioni di zinco con clorochina in una linea di cellule di cancro ovarico umano (A2780). La clorochina migliorato assorbimento di zinco da parte delle cellule A2780 in modo concentrazione-dipendente, come dosati utilizzando una sonda di zinco fluorescente. Questo miglioramento è stato attenuato da TPEN, un composto ad alta affinità di legame metallo-, indicando la specificità della captazione di zinco. Inoltre, l'aggiunta di ioni rame o ferro non aveva effetto sulla captazione di zinco clorochina-indotta. Fluorescente esame microscopico della distribuzione intracellulare di zinco ha dimostrato che gli ioni di zinco liberi sono più concentrati nei lisosomi dopo l'aggiunta di clorochina, che è coerente con le precedenti relazioni che dimostrano che la clorochina inibisce la funzione di lisosomi. La combinazione di clorochina con zinco maggiore chloroquines citotossicità e apoptosi indotta nelle cellule A2780. Così clorochina è un ionoforo di zinco, una proprietà che può contribuire alla chloroquines attività antitumorale. Citazione: Xue J, Moyer A, B Peng, Wu J, Hannafon BN, Ding W-Q (2014) clorochina è un ionoforo zinco. PLoS ONE 9 (10): e109180. doi: 10.1371 / journal. pone.0109180 Editor: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan ricevuti: 25 giugno 2014 Accettate: 10 settembre 2014 Pubblicato: 1 Ottobre 2014 Copyright: 2014 Xue et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License. che consente l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati. Disponibilità dei dati: Gli autori confermano che tutti i dati sottostanti i risultati sono completamente disponibili senza restrizioni. Tutti i dati rilevanti sono all'interno della carta. Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal American Cancer Society (CNE-117557) Susan G. Komen per la Fondazione Cure (KG081083) il programma NIH OK-INBRE (3P20RR016478-09S2) e il Centro di Oklahoma per l'Avanzamento di Scienza e Tecnologia (HR09-025). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Conflitto di interessi: Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in gioco. Introduzione clorochina è un farmaco antimalarico che è stato usato in esseri umani per molti anni 1. Negli ultimi anni, Clorochina ha dimostrato di inibire l'autofagia e indurre apoptosi in cellule maligne e quindi è stato testato in diversi sistemi modello sperimentale 2 e in studi clinici umani 3. 4. Gli studi hanno dimostrato che la clorochina sensibilizza le cellule tumorali alla radioterapia o chemioterapia 5 6 8. Pertanto, la clorochina potrebbe potenzialmente essere un efficace farmaco antitumorale in oncologia clinica. È stato anche dimostrato che la clorochina sensibilizza cellule del cancro della mammella alla chemioterapia indipendente inibizione autofagia 9. ed i potenziali effetti collaterali della terapia clorochina sono stati anche cautamente discusso 10. 11. Ciò indica che una comprensione più dettagliata del meccanismo chloroquines antitumorale è necessario per sviluppare ulteriormente questo composto in un agente antitumorale efficace. Clorochina esercita un effetto pleiotropico in cellule eucariotiche, compresa una elevazione di pH vacuolare quando intrappolati in organelli acidi, come lisosomi. Questo aumento del pH interrompe lisosomiale acidificazione porta alla compromissione della fusione autofagosoma e degrado autofagica 12. 13. A livello molecolare, clorochina ha dimostrato di agire sinergicamente con un inibitore AKT per indurre la morte cellulare tumorale 14. Tuttavia, la nostra comprensione di chloroquines l'azione a livello cellulare e molecolare nelle cellule tumorali è abbastanza limitato. Abbiamo precedentemente riportato che l'attività antitumorale ioni di zinco mostra alterando lisosomi permeabilità della membrana 15 e tramite regolazione dell'espressione genica 16. zinco composti, in particolare ionofori zinco, vincolanti sono un nuovo gruppo di potenziali agenti antitumorali che colpiscono zinco per i lisosomi e inducono lisosomi-mediata apoptosi delle cellule tumorali 17. Inoltre, il ruolo dello zinco nella regolazione autofagia è stato recentemente realizzato 18. considerando che studi precedenti hanno trovato che il metallo complessi contenenti clorochina può portare ad un aumento dell'attività antimalarica 19. sua interazione con ioni zinco è mai stato studiato in qualsiasi sistema biologico. Data l'attività antitumorale riportato di ioni di zinco e clorochina e il loro coinvolgimento nelle funzioni lisosomiali, abbiamo cercato di indagare se gli ioni di zinco interagiscono con clorochina e se questa interazione altera chloroquines attività antitumorale. Si segnala che la clorochina è un ionoforo di zinco, che si rivolge zinco per i lisosomi, e che la combinazione di zinco e clorochina aumenta la loro citotossicità e induce l'apoptosi in un sistema modello cellule di cancro umano. MATERIALI E METODI Materiali L'anticorpo per la caspasi-3 è stato da Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). L'anticorpo LC3B-II era da Stressgen (Ann Arbor, MI). L'anticorpo PARP era da Cell Signaling Technology (Danvers, MA). La sonda AM FluoZin-3 e sonda LysoTracker sono stati acquistati da Life Technologies Co. (Carlsbad, CA). CellTiter 96 soluzione acquosa (saggio MTS) è stato da Promega (Madison, WI). Clorochina difosfato, cloruro di zinco, cloruro rameico, cloruro di ferro, N, N, N, N-tetrakis (2-piridilmetil) etilendiammina (TPEN), Ca-EDTA, l'anticorpo actina e altri agenti chimici erano di grado analitico e acquistati da Sigma - Aldrich (St. Louis, MO). Colture cellulari La linea cellulare di carcinoma ovarico A2780 umano è stato un gentile dono del Dr. Stephen Howell (University of California, San Diego, CA). cellule A2780 sono state coltivate in terreno RPMI 1640 supplementato con siero fetale bovino 10, 100 IU / ml di penicillina, e 100 g / ml di streptomicina. Le cellule sono state coltivate abitualmente in un ambiente umidificato a 37 ° C, 5 CO 2. e diversi passaggi due volte a settimana. Le celle a meno di 20 brani sono stati utilizzati in questo studio. La vitalità cellulare saggio La vitalità cellulare è stato analizzato con un saggio di tetrazolio modificata utilizzando MTS reagente seguendo il protocollo produttori 15. In breve, le cellule A2780 sono stati placcati in una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti (7.510 3 cellule per pozzetto) in 100 l di media, che assicurata una confluenza 4060 cellule dopo 24 ore di crescita. Il mezzo è stato poi sostituito con 100 l di fresco mezzo contenente clorochina e ZnCl 2 a varie concentrazioni, e le cellule sono state coltivate per i periodi indicati. Per ciascun pozzetto, è stato aggiunto 20 l della soluzione MTS, e le cellule sono state incubate a 37 ° C per 1 ora per consentire lo sviluppo del colore. L'assorbanza è stata registrata a 490 nm ed i dati sono stati espressi come percentuale dei valori ottenuti dalle cellule di controllo non trattate. Rilevamento intracellulare di zinco dei lisosomi e ioni di zinco liberi intracellulari è stata effettuata utilizzando il LysoTracker e FluoZin-3 sonde al microscopio a fluorescenza seguendo le istruzioni del produttore 20. cellule A2780 sono stati placcati in un 12-pozzetti ad una densità di 310 cellule per 5 bene . Ventiquattro ore dopo la placcatura, le cellule sono state trattate con clorochina e ZnCl 2 alle concentrazioni indicate per 30 min. Dopo il trattamento il terreno è stato sostituito con terreno fresco (RPMI 1640) contenente 50 nM LysoTracker o / e 1 M FluoZin-3. Dopo incubazione per altri 30 minuti, il terreno è stato rimosso e le cellule sono state lavate tre volte con HBSS (soluzione salina bilanciata Hanks) e visualizzato su un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U. Lo zinco è stato rilevato come un colore verde (FluoZin-03:00 di eccitazione 490/20 nm ed emissione 528/38 nm) e lisosomi come un colore rosso (LysoTracker di eccitazione 555/28 nm ed emissione 617/73 nm). Co-localizzazione di ioni di zinco e lisosomi è stata determinata dalla fusione delle immagini verde e rosso. intensità di fluorescenza sono stati quantificati utilizzando il software NIS-Elements AR (Nikon Instruments). misure a livello cellulare zinco Una forma sensibile e specifico dell'indicatore di zinco fluorescente ad alta affinità FluoZin-3 è stata utilizzata per determinare i livelli di ioni di zinco cellulare 20. La sonda FluoZin-3 è stato inizialmente preparato in DMSO (5 mm magazzino) e ulteriormente diluito in mezzo di coltura prima dell'aggiunta alle cellule. A2780 (110 4 cellule per pozzetto) sono state piastrate in una piastra da 96 pozzetti. Ventiquattro ore dopo la placcatura, le cellule sono state trattate con clorochina per 1 ora in presenza di ZnCl 2 alle concentrazioni indicate. FluoZin-3 (1 M, concentrazione finale) è stato aggiunto e le cellule sono state incubate per altri 30 min a 37 ° C (concentrazione DMSO a medio era inferiore a 0,5). Dopo l'incubazione, le cellule sono state lavate due volte con mezzo fresco per rimuovere il colorante non specifico associato alla superficie cellulare. Ulteriori mezzo è stato aggiunto e le cellule sono state incubate per altri 30 minuti prima misure di fluorescenza sono state effettuate. La fluorescenza è stata misurata a 485/535 nm (eccitazione / emissione), utilizzando un Wallac 1420 Multilabel contatore (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA). Western blot occidentale blot è stata eseguita come descritto 20. 21. In breve, le cellule sono state lisate con un tampone contenente 50 mM Tris (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,5 NP40, 50 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4. 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoro, 25 g / mL leupeptina, e 25 g / mL aprotinina. Il lisato è stato sonicato in ghiaccio per 6 colpi di 10 secondi ciascuno e centrifugati a 15,000g per 15 min. I supernatanti sono stati raccolti per rimuovere il materiale insolubile. Trenta a quaranta microgrammi di proteine ​​da ciascun campione sono stati separati su un gel SDS-PAGE 12, trasferito su una membrana PVDF e cancellati con anticorpi contro caspasi-3, PARP, LC3B-II o actina. Analisi statistica Tutte le analisi statistica è stata effettuata con il software GraphPad Prism (San Diego, CA). One-way ANOVA con l'analisi Bonferroni stata utilizzata per determinare le differenze tra di controllo e sperimentali gruppi, con P0.01 come il livello di significatività statistica. La IC 50 di clorochina, in presenza o assenza di ZnCl 2. sulla vitalità cellulare è stata calcolata con una curva di regressione non lineare (equazione dose-risposta sigmoidale). Risultati clorochina aumenta assorbimento di zinco nelle cellule A2780 Per capire se clorochina (Figura 1) colpisce assorbimento di zinco, le cellule sono state trattate con A2780 100300 M clorochina in presenza di un aumento delle concentrazioni di cloruro di zinco per 1 ora. i livelli di zinco basali intracellulari erano appena rilevabile nelle cellule di controllo, come analizzato usando la sonda FluoZin-3 e un lettore di piastre a fluorescenza, come abbiamo descritto in precedenza 15. 17. L'aggiunta di cloruro di zinco solo leggermente aumentato i livelli di zinco intracellulari che suggeriscono che l'internalizzazione di ioni di zinco è in gran parte limitata dalla struttura della membrana cellulare. Tuttavia, quando la clorochina è stato aggiunto ai livelli di zinco intracellulare mezzo di coltura sono stati notevolmente migliorata (Figura 2A), che indica che gli atti clorochina come ionoforo zinco. Questo miglioramento dei livelli di zinco intracellulare di clorochina era chiaramente dipende dalla quantità di cloruro di zinco e clorochina aggiunto (Figura 2A). esame microscopico fluorescente ulteriormente dimostrato che lo zinco assorbimento viene significativamente migliorata dalla clorochina in questo modello cellulare sistema (Figura 2B). Per determinare la specificità del rilevamento di zinco intracellulare, TPEN, una membrana permeabile stabilita alta affinità di legame metallo-compound 22. 23. stato aggiunto alle cellule prima dell'aggiunta di zinco e clorochina. Come mostrato in figura 3A. pretrattamento con TPEN significativamente attenuato accumulo intracellulare di zinco clorochina-indotta, indicando che la clorochina determinerebbe, zinco nelle cellule. Questa è stata ulteriormente confermata mediante aggiunta di cloruro di ferro o di cloruro di rame, che non ha influenzato enhancement clorochina-indotta dei livelli intracellulari di zinco (Figura 3B). Per assicurarsi che la clorochina non mobilitare ioni zinco da intracellulari molecole leganti zinco, abbiamo pretrattati le cellule con Ca-EDTA, una membrana cellulare chelante metallico impermeabile, prima dell'aggiunta di clorochina. Come mostrato in figura 3A. in presenza di Ca-EDTA clorochina non migliorare segnalazione intracellulare di zinco, sostenendo ulteriormente la conclusione che la clorochina è un ionoforo zinco. Expand Figura 1. La struttura chimica del composto clorochina. sale Clorochina difosfato è stato acquistato da Sigma-Aldrich (San Louis, MO, C6628). Più Espandere Figura 2. Effetti della clorochina sulla captazione ione zinco. A. cellule A2780 sono state piastrate in una piastra da 96 pozzetti e trattati con clorochina (CHQ) da solo o in combinazione con ZnCl 2 alle concentrazioni indicate per 1 ora. La sonda FluoZin-3 (1 M) è stata aggiunta e il segnale fluorescente è stata misurata mediante eccitazione a 490/20 nm ed emissione a 528/38 nm. Dati (n 3, barre, SEM) sono presentate come percentuale del massimo livello di fluorescenza rilevato. , P0.01, rispetto alle cellule senza trattamento CHQ, utilizzando uno ANOVA seguita da analisi di Bonferroni. B. cellule A2780 sono state piastrate in una piastra 12 pozzetti e trattati con CHQ e ZnCl 2 a concentrazioni indicate per 1 ora. Dopo l'aggiunta della sonda FluoZin-3, le cellule sono state esaminate al microscopio fluorescente eccitazione a 490/20 nm ed emissione a 528/38 nm. Indicato sono immagini rappresentative di tre singoli esperimenti. Più Espandere Figura 3. Effetti di CuCl 2. FeCl 2. TPEN e Ca-EDTA on clorochina-indotta assorbimento ione zinco. A. cellule A2780 sono state piastrate in una piastra da 96 pozzetti e pretrattati con TPEN o Ca-EDTA per 15 minuti prima dell'aggiunta di clorochina (CHQ) e ZnCl 2 alle concentrazioni indicate per 1 ora. B. cellule A2780 sono state piastrate in una piastra da 96 pozzetti e trattati con CHQ solo o in combinazione con ZnCl 2. CuCl 2. o FeCl 2 alle concentrazioni indicate per 1 ora. Il FluoZin-3 AM (1 M) sonda è stata quindi aggiunta e segnale fluorescente è stato registrato da eccitazione a 490/20 nm ed emissione a 528/38 nm. Dati (n 3, barre, SEM) sono presentate come percentuale del massimo livello di fluorescenza rilevato. , P0.01, confrontato con la fluorescenza rilevata nelle cellule senza trattamento CHQ, utilizzando One-way ANOVA seguita da analisi di Bonferroni. obiettivi clorochina zinco per i lisosomi nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato che ionofori metallici, come clioquinol, portano ioni di zinco nei lisosomi delle cellule tumorali che portano a lisosomi mediata apoptosi 15. Poiché la clorochina è un lisosomiale stabilito agente 12. 13 targeting. 24. abbiamo esaminato la distribuzione di zinco intracellulare dopo il trattamento delle cellule A2780 con clorochina e zinco. Come mostrato in Figura 4. clorochina accumulo indotta di ioni zinco intracellulari principalmente nei lisosomi, come evidenziato da co-localizzazione dei segnali fluorescenti di FluoZin-3 e LysoTracker. Cliochinolo, uno ionoforo zinco stabilito che rivolge zinco per lisosomi 15. stato utilizzato come controllo positivo (Figura 4B). Così, clorochina è un ionoforo di zinco che gli obiettivi di zinco per lisosomi cellulari. Espandere Figura 4. intracellulare distribuzione ione zinco nelle cellule A2780 dopo il trattamento clorochina. A. cellule A2780 sono state piastrate in una piastra da 6 pozzetti e trattati con clorochina (CHQ) e ZnCl 2 alle concentrazioni indicate per 1 ora. Dopo l'aggiunta di sonde FluoZin-3 e LysoTracker, le cellule sono state esaminate mediante microscopia confocale (eccitazione, 490/20 nm, emissione, 528/38 nm per FluoZin-3 555/28 nm, 617/73 nm per LysoTracker rispettivamente) . Indicato sono immagini rappresentative di tre singoli esperimenti. B. cellule A2780 sono state piastrate in una piastra 12 pozzetti e trattati con clioquinol (CQ) e ZnCl 2 alle concentrazioni indicate per 1 ora. immagini confocali sono state catturate come abbiamo descritto in precedenza 17. Gli ioni zinco migliorare chloroquines citotossicità Per determinare se l'aggiunta di zinco e clorochina può uccidere più efficacemente le cellule tumorali, cellule A2780 sono state trattate con concentrazioni crescenti di clorochina in presenza di cloruro di 25 M di zinco per 72 ore. Analisi vitalità cellulare indicato che ioni di zinco significativamente migliorati chloroquines citotossicità in questo modello di sistema (Figura 5A). La IC 50 di clorochina, che è tipicamente circa 22310 M in cellule A2780, è stata ridotta a 1019 M in presenza di cloruro di zinco 25 M. Inoltre, la combinazione di clorochina e trattamento di zincatura significativamente migliorata apoptosi come evidenziato da caspasi-3 attivazione e PARP (Figura 5B). Gli ioni di zinco anche migliorato chloroquines autofagia attività inibitoria come indicato dalla LC3B-II di rilevamento (Figura 5B). Espandere Figura 5. Effetti della clorochina, più di zinco su caspasi 3 di attivazione e di espressione LC3B-II. cellule A2780 sono state trattate con clorochina (CHQ) o ZnCl 2. soli o in combinazione alle concentrazioni indicate. I lisati cellulari sono stati preparati e Western Blot è stato eseguito utilizzando anticorpi primari contro pro-caspasi 3, LC3B-II, PARP, e actina. Visualizzati sono macchie rappresentativi di tre esperimenti singoli. Discussione Il romanzo ritrovamento di questo studio è che la clorochina è un ionoforo di zinco, che contribuisce alla nostra comprensione della chloroquines attività biologica in cellule tumorali umane. Mentre clorochina è stato studiato in ricerca biomedica 12. 13 e utilizzato per il trattamento della malaria 1 e altre malattie umane 25. 26. questa attività del composto non è stato precedentemente riportato. La conclusione che la clorochina è un ionoforo di zinco è basato sul rilevamento di livelli di zinco intracellulari significativamente elevati quando entrambi zinco e clorochina sono stati aggiunti al mezzo di coltura cellulare. La sonda fluorescente zinco utilizzato in questo studio è un indicatore intracellulare consolidata per gli ioni di zinco ed è stato convalidato in studi precedenti per il rilevamento di zinco specifico 15. 27. 28. Nel corso di studio, la specificità della rilevazione di zinco è stata confermata con l'uso di TPEN, un'affinità alta compound 22. che ha bloccato l'assorbimento di zinco clorochina-indotta legame metallo. Inoltre, in presenza di Ca-EDTA, una membrana chelante metallico impermeabile, clorochina non ha migliorare i livelli di zinco intracellulari, indicando che porta specificamente zinco extracellulare in cellule che permettono di migliorare i livelli di zinco intracellulari. È interessante notare che l'aggiunta di ioni ferro o rame non ha influenzato assorbimento di zinco clorochina-indotta, indica ulteriormente che la clorochina può essenzialmente agire come ionoforo zinco. L'affinità di un composto metallico vincolante per diversi metalli può drasticamente differire 29. Pertanto se clorochina agisce anche come uno ionoforo per altri ioni metallici come rame e ferro rimane da determinare. Le concentrazioni molari dei metalli utilizzati in questo studio erano basati sulle nostre precedenti relazioni 15. 23. Mentre l'affinità di legame di clorochina per vari ioni metallici deve essere ulteriormente definita, l'attività di zinco ionoforo di questo composto fornisce una nuova comprensione di come clorochina, in presenza di zinco, può esercitare i suoi effetti antitumorali. Abbiamo precedentemente riportato che i composti, come clioquinol vincolante metallo, indirizzare zinco per lisosomi in modo da indurre l'apoptosi 15. Lo stesso sembra essere vero per la clorochina, come evidenziato dalla co-localizzazione dello zinco con i lisosomi e l'induzione di apoptosi quando le cellule erano trattati con la combinazione di clorochina e zinco. Questi dati suggeriscono che clioquinol e clorochina può in parte condividono un meccanismo simile nella loro azione antitumorale. Entrambi i composti sono attualmente utilizzate negli esseri umani per altre indicazioni 25. 26. 30 e hanno dimostrato attività antitumorale in sistemi modello sperimentale 6 8. 20. Il fatto che gli atti clorochina come ionoforo zinco supporta ulteriormente la nostra recente affermazione che ionofori metallo sono una nuova gruppo di composti antitumorali, che meritano un ulteriore approfondimento 17. È interessante notare che la combinazione di clorochina e zinco altera livelli proteici LC3B-II nel nostro modello, indicando che lo zinco colpisce chloroquines effetto inibitorio sulla autofagia. Il fatto che lo zinco migliora anche l'apoptosi clorochina-indotta in cellule A2780 suggerisce che l'inibizione di autophagy e induzione dell'apoptosi da clorochina è probabilmente un evento sequenziale in questo sistema modello. Ciò è coerente con l'osservazione che l'inibizione di autofagia cellulare porta a risultati pro-apoptotici in cellule tumorali umane 31. In conclusione, abbiamo identificato clorochina come ionoforo di zinco, che rivela una nuova visione di attività chloroquines antitumorale. Poiché sia ​​clorochina e zinco sono considerati potenziali agenti antitumorali, la combinazione dei due può essere una nuova strategia per sviluppare approcci più efficaci nella gestione del cancro. Autore Contributi ideato e progettato gli esperimenti: JX AM WQD. Eseguita gli esperimenti: JX AM BNH BP. Ha analizzato i dati: JX AM BNH JW WQD. Contributo reagenti / materiali / strumenti di analisi: JW WQD. Ha scritto il giornale: JX BNH WQD. Riferimenti 1. 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